外泌體（Exosome）發(fā)現(xiàn)于1986 年，是一種直徑約30~100nm 的雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)小體，可由機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞如免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、心血管細(xì)胞、 網(wǎng)織紅細(xì)胞、 血小板、 神經(jīng)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等主動(dòng)分泌產(chǎn)生， 廣泛分布于外周血、尿液、唾液、 乳汁、腹水、羊水等體液中。

外泌體攜帶大量特異性的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物質(zhì)，在體內(nèi)參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過(guò)程，與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)程密切相關(guān)。由于外泌體的特殊結(jié)構(gòu)和功能， 使得它具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，一方面可以作為診斷多種疾病的生物指標(biāo)，另一方面也可以作為治療手段，未來(lái)有可能作為藥物的天然載體用于臨床治療。

01

外泌體研究，應(yīng)選用血漿還是血清？

答：

血清是血液凝固之后收集的液體，所以其中少了纖維蛋白原，凝血因子，以及多了很多凝血產(chǎn)物。纖維蛋白原可轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，具有凝血功能。在凝血過(guò)程中血小板會(huì)分泌大量的外泌體，有研究發(fā)現(xiàn)血清中有接近50%的外泌體來(lái)自額外的分泌。

血漿=血液-血細(xì)胞

血清=血漿-纖維蛋白原-凝血因子

所以一般實(shí)驗(yàn)選擇血漿，在特殊情況下，如研究與血小板相關(guān)的疾病的時(shí)候，當(dāng)然是血清更適合。

02

外泌體的分離方法這么多，選擇哪種更好？

答：

外泌體的分離純化一直是科研工作者關(guān)注的問(wèn)題，獲得高純度的外泌體對(duì)后續(xù)的研究至關(guān)重要。據(jù)了解，目前人們多采用超速離心、免疫磁珠、 超濾、 沉淀或試劑盒等方法實(shí)現(xiàn)外泌體的提取分離：
1、 超速離心法（差速離心）

超離法是常用的外泌體純化手段，采用低速離心、高速離心交替進(jìn)行（ 如圖所示） ，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡(jiǎn)單，獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎，但過(guò)程比較費(fèi)時(shí)，且回收率不穩(wěn)定（可能與轉(zhuǎn)子類型有關(guān)），純度也受到質(zhì)疑；此外，重復(fù)離心操作還有可能對(duì)囊泡造成損害，從而降低其質(zhì)量。

2、密度梯度離心

在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法。通過(guò)密度梯度離心，樣品中的外泌體將在 1.13-1.19g/ml
的密度范圍富集。此法獲得的外泌體純度較高，但步驟繁瑣，耗時(shí)。

3、超濾離心

由于外泌體是一個(gè)大小約幾十納米的囊狀小體，大于一般蛋白質(zhì)，利用不同截留相對(duì)分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜對(duì)樣品進(jìn)行選擇性分離，便可獲得外泌體。超濾離心法簡(jiǎn)單高效，且不影響外泌體的生物活性，是提取細(xì)胞外泌體的一種新方法。

4、磁珠免疫法

外泌體表面有其特異性標(biāo)記物（如 CD63、 CD9 蛋白），用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合，即可將外泌體吸附并分離出來(lái)。磁珠法具有特異性高、操作簡(jiǎn)便、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點(diǎn)，但是效率低，外泌體生物活性易受 pH 和鹽濃度影響，不利于下游實(shí)驗(yàn)，難以廣泛普及。

5、PEG-base 沉淀法

聚乙二醇（ PEG）可與疏水性蛋白和脂質(zhì)分子結(jié)合共沉淀，早先應(yīng)用于從血清等樣本中收集病毒，現(xiàn)在也被用來(lái)沉淀外泌體，其原理可能與競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合游離水分子有關(guān)。利用PEG沉淀外泌體存在不少問(wèn)題：比如純度和回收率低，雜蛋白較多（ 假陽(yáng)性），顆粒大小不均一，產(chǎn)生難以去除的聚合物，機(jī)械力或者吐溫-20 等化學(xué)添加物將會(huì)破壞外泌體等，因此發(fā)表文章時(shí)易受質(zhì)疑。

6、 試劑盒提取

近幾年來(lái)，市場(chǎng)上已出現(xiàn)各種商業(yè)化的外泌體提取試劑盒，有的是通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的過(guò)濾器過(guò)濾掉雜質(zhì)成分，有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進(jìn)行分離純化，也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來(lái)。

03

外泌體提取試劑提取外泌體檢測(cè)需要多少血漿呢？

答：

1-2mL的血漿足夠后續(xù)的QPCR檢測(cè)；4mL的血清或血漿可滿足RNA測(cè)序和蛋白質(zhì)譜的需求。

04

如何鑒定提取出來(lái)的外泌體？

答：

根據(jù)國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)于2014年發(fā)表的一個(gè)指導(dǎo)手冊(cè)（MISEV），鑒定外泌體首先需要通過(guò)WB來(lái)鑒定細(xì)胞外囊泡的標(biāo)志蛋白是否存在于樣品中，通過(guò)電子顯微鏡來(lái)觀察樣品中細(xì)胞外囊泡的形態(tài)特征，通過(guò)NTA等手段來(lái)分析樣品中細(xì)胞外囊泡的群體特征（粒子濃度、直徑分布等）。

05

提取出來(lái)的外泌體能否應(yīng)用于細(xì)胞共培養(yǎng)？

答：

我們提取出來(lái)的外泌體通過(guò)粒徑檢測(cè)能判斷其純度（粒徑大小均在外泌體的大小范圍），電鏡檢測(cè)能判斷其形態(tài)確為外泌體。

如果樣品中的外泌體有活性的話是可以進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)的。

06

外泌體如何保存？

答：

純化完成后的外泌體可分裝成50-100uL后置于-80℃保存。

07

外泌體提取試劑盒從2mL血清血漿提取出來(lái)的外泌體能有多少？

答：

2mL血清血漿提取出來(lái)的外泌體數(shù)量約1*10的8次方-9次方，可以滿足后續(xù)的電鏡和WB。

08

BCA方法測(cè)定的蛋白濃度是多少？

答：

BCA方法測(cè)定的蛋白濃度為2~4ug/uL。

09

外泌體電鏡是不是一定要有膜結(jié)構(gòu)，無(wú)膜結(jié)構(gòu)的球體對(duì)不對(duì)？

答：

負(fù)染電鏡結(jié)果中外泌體的形態(tài)肯定是那種明顯的茶托樣或者大餅樣的！邊緣有一圈略微更明亮的亮圈。如果你打到的結(jié)構(gòu)是沒(méi)有膜結(jié)構(gòu)的圓球形，那么您很可能看到了脂蛋白顆粒或者抱團(tuán)的蛋白質(zhì)。

10

為什么超速離心提取外泌體看不到沉淀？

答：

這種問(wèn)題通常有三種可能性：

1）使用的細(xì)胞上清或者血清量太低，從而造成了這樣的結(jié)果。

2）使用了不透明的超速離心管，一般來(lái)說(shuō)外泌體產(chǎn)量都比較小，所以凡是不透明的管子，基本都是很難見(jiàn)到明顯沉淀的，可以當(dāng)做有沉淀，然后操作下去即可。

3）使用了角轉(zhuǎn)。部分品牌離心機(jī)的角轉(zhuǎn)管壁粘附性很低，超離結(jié)束沒(méi)多久沉淀就會(huì)滑落下去，所以請(qǐng)?jiān)陔x心結(jié)束時(shí)趕緊去收樣。