細(xì)胞傳代培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一，也是幾乎所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂，細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止，且也會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于細(xì)胞生長(zhǎng)或發(fā)生中毒。因此，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿(mǎn)后就需要將其稀釋?zhuān)址N成多瓶，細(xì)胞才能繼續(xù)生長(zhǎng)。這一過(guò)程就叫傳代。

細(xì)胞傳代作為一種常規(guī)的實(shí)驗(yàn)操作，不但可以擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)的數(shù)量，同時(shí)也可以避免細(xì)胞因進(jìn)入平臺(tái)期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。所以為了讓細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，維持細(xì)胞旺盛的分裂能力，這時(shí)候就需要進(jìn)行細(xì)胞傳代。

細(xì)胞傳代要在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下進(jìn)行，并且根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法：

? 貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代；

? 部分貼壁生長(zhǎng)但貼壁不牢固的細(xì)胞可以采用直接吹打傳代；

? 懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心沉淀后再分離傳代，或直接用自然沉淀法吸除上清后，再吹打傳代。

上次講了細(xì)胞復(fù)蘇操作，今天來(lái)講講細(xì)胞傳代的操作（適用于貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)）！

細(xì)胞復(fù)蘇流程圖

細(xì)胞傳代流程圖

01

細(xì)胞傳代前準(zhǔn)備

? 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將15mL離心管、移液管、槍頭等實(shí)驗(yàn)需要用到的耗材放入無(wú)菌超凈工作臺(tái)，紫外線(xiàn)照射30min。

? 將*培養(yǎng)基、PBS、胰酶預(yù)熱至37℃。

? 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)密度，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%~90%匯合度即可進(jìn)行傳代。

02

胰蛋白酶/EDTA消化

? 棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基，重復(fù)洗兩次。

注意：

貼壁加入到培養(yǎng)皿的邊緣，不能直接對(duì)著細(xì)胞加入PBS，容易把細(xì)胞都吹起來(lái)。這一步的目的是為了去掉殘余的培養(yǎng)基，殘余的培養(yǎng)基會(huì)含有血清和一些離子等，不利于接下來(lái)的消化。

? 棄去PBS，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA（T25培養(yǎng)瓶加入約1.5mL，T75培養(yǎng)瓶加入約3mL），迅速鋪勻，保證充分接觸細(xì)胞表面（消化時(shí)間視具體細(xì)胞而定）。

? 顯微鏡下觀察消化情況，約70%~80%細(xì)胞收縮變圓后，輕拍培養(yǎng)容器外壁，使細(xì)胞脫離培養(yǎng)表面。立即加入2倍胰酶量的*培養(yǎng)基輕搖培養(yǎng)容器，使培養(yǎng)基和胰酶迅速混勻，終止消化。

? 使用吸管或移液管輕輕吹打細(xì)胞表面，吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次，盡可能將細(xì)胞都吹打下來(lái)。

注意：

吹打動(dòng)作不可劇烈，避免產(chǎn)生大量氣泡，否則可能損傷和損失細(xì)胞。

? 取所有細(xì)胞懸液放入無(wú)菌15mL離心管內(nèi)，250×g，室溫離心4min。

03

細(xì)胞培養(yǎng)

? 離心后去除上清。加入適量*培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞沉淀，充分吹散、混勻，計(jì)數(shù)。將細(xì)胞按(2.5~4)×104個(gè)活細(xì)胞/cm2接種至適宜的培養(yǎng)容器內(nèi)。

? 搖勻細(xì)胞，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中。

? 傳代次日，觀察細(xì)胞狀態(tài)。若發(fā)現(xiàn)較多漂浮細(xì)胞，應(yīng)予以換液。

? 待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%匯合度，即需傳代或凍存。

注意事項(xiàng)

胰酶濃度

推薦胰酶使用濃度為0.25%-0.04%EDTA，使用之前需預(yù)熱至37℃且pH值應(yīng)維持在7.2左右。切忌消化過(guò)度（包括胰酶濃度過(guò)高、消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等），否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡、分化、狀態(tài)變差，分化能力丟失等現(xiàn)象。細(xì)胞消化過(guò)程中需要在顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化程度，當(dāng)看到大部分細(xì)胞變圓不貼壁，拍打培養(yǎng)瓶?jī)蓚?cè)會(huì)有大量細(xì)胞脫落，此時(shí)應(yīng)立即終止消化；若細(xì)胞仍有大部分貼壁，可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間以避免消化不*的情況出現(xiàn)。

細(xì)胞的差異

不同種類(lèi)的干細(xì)胞差異很大，特別是與腫瘤細(xì)胞株的差異更大，很多經(jīng)驗(yàn)不可以直接使用，消化時(shí)需要仔細(xì)摸索最佳的時(shí)間。

接種密度

干細(xì)胞傳代過(guò)程中接種密度至關(guān)重要，如果太低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖緩慢，甚至導(dǎo)致細(xì)胞老化，而細(xì)胞的老化是不可逆轉(zhuǎn)的。一般細(xì)胞接種密度為20000個(gè)活細(xì)胞/cm2即5×105個(gè)活細(xì)胞/T25，不同的干細(xì)胞接種密度會(huì)稍有差異，比如hMSC，我們推薦的傳代接種比例為1:2。

吹打細(xì)胞動(dòng)作要輕柔

吹打動(dòng)作不可劇烈，避免產(chǎn)生大量氣泡，否則可能損傷和損失細(xì)胞。