實(shí)驗(yàn)方法原理

硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)。用此方法可以將主要的免疫球從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來(lái)。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來(lái)沉淀不同的蛋白質(zhì)。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來(lái)表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用廣。

實(shí)驗(yàn)材料 動(dòng)物血清樣品

試劑、試劑盒 硫酸銨NH4OHPB液BaCl2溶液納氏液洗脫液生理鹽水

儀器、耗材 透析袋離心機(jī)燒杯攪拌棒

實(shí)驗(yàn)步驟

一、材料與試劑配制

1.  動(dòng)物血清

2.  硫酸銨飽和溶液

硫酸銨：800 g~850 g

H2O ：1 000 ml

加熱至絕大部分溶質(zhì)溶解為止，趁熱過(guò)濾，置室溫過(guò)夜，然后以28% NH4OH調(diào)pH至7.0（不調(diào)pH值也可以）。

注：硫酸銨以質(zhì)量?jī)?yōu)者為佳，因次品中含有少量重金屬對(duì)蛋白質(zhì)巰基有影響。如次品必須除去重金屬，可在溶液中通入H2S，靜置過(guò)夜后濾過(guò)，加熱蒸發(fā)H2S即可。

3.  0.01 mol/L pH7.4 PB液

A液：0.10 mol/L NaH2PO4液

NaH2PO4·2H2O ：15.60 g

加H2O至1 000 ml

B液：0.10Mol/L Na2HPO4液

Na2HPO4·12H2O： 35.80 g

加H2O至1 000 ml

取A液19 ml，B液81 ml加水至1 000 ml即可。

4.  1%BaCl2溶液

5.  納氏液

HgI ：115.00 g

KI： 80.00g

加H2O至500.00 ml

溶化后過(guò)濾，然后再加20%NaOH 500.00 ml，混合即可。

6、0.50 mol/L的HCl液和0.50 mol/L的NaOH液

7、洗脫液

0.03 mol/L的NaCl液。

8、透析袋（或玻璃紙）

二、操作方法

1.  取20 ml血清，加生理鹽水20 ml，再逐滴加入（NH4）2SO4飽和溶液10 ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30 min。

2.  3 000 r/min離心20 min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。

3.  在上清液中再加（NH4）2SO4飽和溶液30 ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，靜置30 min。

4.  3 000 r/min離心20 min，棄上清。

5.  于沉淀中加20 ml生理鹽水，使之溶解，再加（NH4）2SO4飽和溶液10 ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，靜置30 min。

6.  3 000 r/min離心20 min，棄上清，以除去白蛋白。重復(fù)步驟5，2~3次。

7.  用10 ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。

8.  透析除鹽，在常水中透析過(guò)夜，再在生理鹽水中于4℃透析24 h，中間換液數(shù)次。

以1%BaCl2檢查透析液中的SO42-或以納氏試劑檢查NH4 （取3~4 ml透析液，加試劑1~2滴，出現(xiàn)磚紅色即認(rèn)為有NH4 存在），直至無(wú)SO42-或NH4 出現(xiàn)為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。

9.  離心去沉淀（去除雜蛋白），上清液即為粗提IgG （即γ球蛋白，如以36%的飽和硫酸銨沉淀血清的產(chǎn)物即為優(yōu)球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白）。

10.  過(guò)DEAE－纖維素層析柱。以0.01 mol/L pH7.4 PBS（0.03 mol/L NaCl）洗脫，收集洗脫液。也可采用SephadexG150或G200柱。

11.  蛋白質(zhì)及其定量鑒定。

12.  IgG的純度鑒定可采用下列方法之一鑒定。

（1）區(qū)帶電泳

玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可。加樣電泳后，只在γ—球蛋白的遷移部位出現(xiàn)一條帶。操作時(shí)，同時(shí)可用全血清樣品，不同濃度（NH4）2SO4鹽析樣品進(jìn)行電泳，以資比較。

（2）瓊脂雙相雙擴(kuò)散鑒定

預(yù)先準(zhǔn)備該IgG免疫異種動(dòng)物所獲的抗IgG血清。將IgG與抗IgG血清進(jìn)行雙相雙擴(kuò)散，如IgG提純的話，則在兩樣品孔之間出現(xiàn)一條沉淀線。

（3）免疫電泳鑒定

孔內(nèi)加待測(cè)樣品，電泳后，在槽內(nèi)加抗IgG血清，瓊脂擴(kuò)散24h，觀察結(jié)果。如果提取的IgG純的話，則只出現(xiàn)一條弧形的沉淀線，且沉淀線位于γ—球蛋白區(qū)。此鑒定必須同時(shí)進(jìn)行全血清及抗血清抗體的免疫電泳，以資比較。

（4）圓盤(pán)電泳鑒定

用全血清樣品及提純樣品同時(shí)進(jìn)行圓盤(pán)電泳。全血清樣品在圓盤(pán)電泳上出現(xiàn)數(shù)十條區(qū)帶，而純化的IgG則只有一條區(qū)帶。

13.  IgG的濃縮與保存

（1）IgG的濃縮

（2）IgG的保存

一般濃縮至1%以上的濃度，再分裝成小瓶?jī)龈杀４?，或?.01%硫柳汞在普通冰箱或低溫冰箱保存，注意防止反復(fù)凍融。